l
l Kollagenelektroforesemønster etter utsalting.
Enzymatisk ekstraksjon betyr at etter at løselig kollagen og syreløselig kollagen er ekstrahert, må noen proteaser, som kollagenase, pepsin, papain og chymotrypsin, hydrolyseres for å oppnå forskjellige enzymatisk løselige kollagener. Proteasene som brukes er hovedsakelig delt inn i 3 typer: dyreproteaser (som trypsin, pepsin), planteproteaser (som papain, bromelain) og mikrobielle proteaser (som alkaliske proteaser, nøytrale proteaser). I forskningen på enzymatisk hydrolyse av kollagen er alkalisk protease den mest brukte.
Kollagenet brytes ned på en begrenset måte, det vil si at det terminale peptidet spaltes. Siden de kovalente bindingene mellom kollagenpeptidkjedene dannes ved interaksjon av lysin eller hydroksylysin i det molekylære terminale peptidet, spaltes det terminale peptidet. Hoveddelen som inneholder trippelhelixstrukturen kan løses opp i fortynnede organiske syrer og ekstraheres. Enzymbehandling kan hydrolysere det terminale peptidet til kollagenfibrin, forbedre utbyttet av kollagen; og det vil ikke ødelegge trippelhelixstrukturen til kollagen og opprettholde dens egenskaper. Det er mange faktorer som påvirker enzymekstraksjon, som enzymkonsentrasjon, forhold mellom enzym og substrat, enzymatisk hydrolysetid, enzymatisk hydrolysetemperatur, pH-verdi og materiale-til-væske-forhold. I faktisk drift ekstraheres det meste av kollagenet ved hjelp av enzymforbindelsesmetoden, og mer ekstraheres av pepsin, og den organiske syren er for det meste eddiksyre.
l Elektroferogram av pepsin-ekstrahert kollagen
Prosessen med enzymatisk hydrolyse av kollagen er hovedsakelig delt inn i enkelt-enzym hydrolysemetode og multi-enzym hydrolysemetode. Den multi-enzymatiske hydrolysemetoden er videre delt inn i blandet enzymatisk hydrolysemetode (som bovin trypsin, pronase, bacillus protease blandet) og trinn-for-steg enzymatisk hydrolysemetode. Valget av spesifikke eksperimentelle prosesser og betingelser for enzymatisk ekstraksjon av hudkollagen bør vanligvis utvikles. For å oppnå kollagenpolypeptider med mindre molekylvekter, brukes vanligvis multi-enzymhydrolyse. Hovedfaktorene som påvirker effekten av enzymolyse er typen enzym, mengden tilsatt enzym, temperaturen på enzymolyse, tidspunktet for enzymolyse, pH-verdi og forholdet mellom materiale og vann. Bruk av enzymatisk ekstraksjon av kollagen i aggregat kan ikke bare effektivt forkorte ekstraksjonstiden, men også oppnå kollagen med god biologisk aktivitet, og forurensningen til miljøet er også liten. Kollagen hydrolyseres ikke lett av vanlig protease, men kan brytes av animalsk kollagenase, og de ødelagte fragmentene kan hydrolyseres av vanlig protease etter automatisk denaturering. De passende forholdene for pepsin til å hydrolysere kollagen er pH 1.65-1.70 og temperatur 37 grader.
Noen bruker grisebein som råmateriale og bruker den enzymatiske hydrolysereaksjonen til protease for å erstatte den tradisjonelle limfremstillingsprosessen og utføre eksperimentell forskning på den enzymatiske hydrolysereaksjonen av kollagen og den enzymatiske limfremstillingsprosessen. Resultatene viste at pepsin hadde den høyeste utvinningshastigheten av kollagen (46,14 prosent), etterfulgt av trypsin (43,42 prosent), nøytral protease (30,14 prosent) og alkalisk protease (21,15 prosent). De viktigste påvirkningsfaktorene i den pepsinenzymatiske hydrolysereaksjonen ble optimalisert ved enkeltfaktor- og ortogonale eksperimenter. Testresultatene viser at de optimale betingelsene for pepsinekstraksjon er at konsentrasjonen av pepsin er 1 prosent, enzymatisk hydrolyse utføres ved pH 2,0 i 48 timer, og deretter saltes ut i NaCl-løsning med en konsentrasjon på 10 prosent (w/v). ) i 24 timer. Den endelige utvinningsgraden for kollagen var 64,77 prosent, og utvinningshastigheten for kollagen var 49,75 prosent. Noen mennesker brukte også pepsin for å ekstrahere kollagen fra svineskinn, og hydrolyserte fire forskjellige pepsindoser (1 prosent, 2 prosent, 2,5 prosent, 3 prosent) prøvetaking og testing, førsteordens HILL-ligningen ble brukt til å simulere prosessen med pepsinekstraksjon av grisehudkollagen og nedbrytningsprosessen for pepsinhydrolysehastighet, og til slutt ble ekstraksjonshastigheten på 2 prosent pepsindosering og 6-7h hydrolysetid oppnådd. maksimum. Noen bruker fersk griseskinn som råmateriale, hydrolyserer med trypsin under tilstanden 50-52 grad, enzymdoseringen er 5000:1 ~ 10000:1, pH-verdien er 9, reaksjonen er 2-3 h, råmaterialet: vann er Enzymatisk hydrolyse under forhold 1:2. Resultatene viste at utvinningshastigheten av totalt protein var større enn eller lik 80 prosent.
l Gjenopprettingshastighet for kollagen i blekkspruthud med pepsin under variabel temperatur.
Når du bruker den enzymatiske metoden for å trekke ut kollagen, må ekstraksjonsforholdene kontrolleres strengt:
For det første må enzymets virkningstid være passende. Hvis tiden er for kort, vil ikke kollagenet frigjøres fullt ut i ekstraktet, noe som vil påvirke ekstraksjonshastigheten; hvis enzymets virkningstid er for lang, vil kollagenet hydrolyseres for mye, noe som resulterer i for mye bittert småmolekylært oligopeptid, som ikke bare vil øke separasjons- og renseeffektiviteten. Vanskeligheten påvirker også kollagenets funksjonelle egenskaper og biologiske aktivitet.
For det andre bør den enzymatiske hydrolysetemperaturen være passende. Hvis temperaturen er for lav, er effekten av enzymet ikke åpenbar; hvis temperaturen er for høy, vil det føre til inaktivering av enzymet og denaturering av kollagen. Ifølge rapporter, når pH i mediet er litt lavere enn nøytral, er denatureringstemperaturen til kollagen 40-41 grader, når pH i mediet er sur, er denatureringstemperaturen til kollagen 38-39 grad , og denatureringstemperaturen til kollagen fra fiskeskinn er den 7-12 grad lavere enn denatureringstemperaturen til kollagen i svineskinn. Derfor, hvis det ekstraherte kollagenet skal ha god biologisk aktivitet, bør ekstraksjonstemperaturen være lavere enn denatureringstemperaturen under ekstraksjonsprosessen.
For det tredje må det riktige enzymet velges. Generelt, når man ekstraherer kollagen fra terrestrisk pattedyrvev, er det rimelig å bruke pepsin for å ekstrahere ved dens optimale temperatur, men for vannlevende dyr som fisk er denatureringstemperaturen til kollagen lavere enn for landpattedyr. Derfor er mange proteaser ikke egnet, og noen funksjonelle egenskaper og biologiske aktiviteter til kollagen kan bli ødelagt hvis de ekstraheres ved den optimale temperaturen for disse enzymene. Forskningen på utvinning av kollagen og dets polypeptider ved hjelp av enzymatiske metoder er hovedsakelig fra dyreskinn og deres biprodukter, og det er få rapporter om bruk av enzymatiske metoder for å trekke ut kollagen og dets polypeptider fra dyrebein.
